DNA的降解

测序策略

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等(1977)提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的澳门金沙官网投注降解法。虽然其原理大相径庭,但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上,即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

DNA测序的澳门金沙官网投注降解(切割)法的基本思路或步骤是什么

Maxam和Gilbert几乎是同时发明的,所以,同获诺贝尔奖。

这一方法的基本步骤为:

(1)先将DNA的末端之一进行标记,通常为放射性同位素32P;

(2)在多组互相独立的澳门金沙官网投注反应中分别进行特定碱基的澳门金沙官网投注修饰;

(3)在修饰碱基位置澳门金沙官网投注法断开DNA链;

(4)凝胶电泳将DNA链按长短分开;

(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列

澳门金沙官网投注降解较之链终止法具有明显优点:所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。

与包括合成反应的链终止技术不同,Maxam-Gilbert法要对原DNA进行澳门金沙官网投注降解。这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。在这一方法(Maxam和Gilbert,1980)中,一个末端标记的DNA片段在5组互相独立的的澳门金沙官网投注反应分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成5组放射性标记的分子,从共同起点(放射性标记末端)延续到发生澳门金沙官网投注降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后,各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。相对而言,Maxam-Gilbert法自初次提出以来,基本没有变化。虽然设计了另一些澳门金沙官网投注降解反应,但这些反应一般只作为Maxam和Gilbert(1977,1980)最早提出的反应的补充。这一方法的成败,完全取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。第一步先对特定碱基(或特定类型的碱基)进行澳门金沙官网投注修饰,而第二步修饰碱基从糖环上脱落,修饰碱基5'和3'的磷酸二酯链断裂。在每种情况下,这些反应都要在精心控制的条件下进行,以确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5'和3'位置,得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A+G、C+T、C和A>C各个泳道,从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。由于种种原因(如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA 的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等),Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些,它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。在70年代Maxam-Gilbert 法和Sanger法刚刚问世时,利用澳门金沙官网投注降解进行测序不但重现性更高,而且也容易为普通研究人员所掌握。

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